Zhaoyang Liu1, Janani Ramachandran2, Steven A. Vokes2 and Ryan S. Gray1,3,*

摘要

特发性脊柱侧凸(IS)是影响世界各地儿童最常见的肌肉骨骼缺损类型，并根据发病年龄、位置和脊柱弯曲程度进行分类。发病于婴儿期的IS疾病虽然罕见，但病情较严重，进展迅速，因呼吸系统严重受损，死亡率增加。IS的病理生理学，特别是婴儿IS，仍然是未知的。在这里，我们证明了PRMT5在小鼠婴儿IS表型中的作用。骨软骨祖细胞中PRMT5的条件遗传消融导致围产期脊柱中软骨内骨形成的不对称缺陷和肥大软骨细胞分化受损。对这些软骨内成骨标志物的分析显示，在Prmt5条件突变小鼠的椎体生长板和椎间盘区域中，X型胶原蛋白(COLX)和Ihh表达增加，Mmp13和RUNX2表达显著降低。我们还证明PRMT5在成年小鼠的椎间盘和椎体生长板中有持续的作用。总之，我们的结果确立了PRMT5在脊柱发育和稳态过程中作为终端肥大软骨细胞分化和软骨内骨形成的关键启动子。

介绍

特发性脊柱侧凸(IS)是最常见的儿童脊柱畸形，其特点是脊柱侧弯10°，影响全球约3%的儿童(Wise等人，2008年)。IS的临床分型是基于婴儿(出生到3岁)、青少年(3到11岁)和青少年的发病年龄

(11岁及以上)年龄(Giampietro et al.， 2003)。婴儿IS发展迅速，可导致呼吸系统严重受损，发病率和死亡率增加(Cahill和Samdani, 2012;戴维斯和里德，1970年;Pehrsson等人，1992;Roye, 2018)。因此，迫切需要早期诊断和合理治疗，以阻止或改善婴幼儿is的发病机制。兄弟姐妹风险研究报告11.5-19%的兄弟姐妹共同承担脊柱弯曲10°的风险(Riseborough and Wynne-Davies, 1973;Rogala等人，1978)。尽管有这种强烈的基因信号，但IS的病因仍然不清楚。然而，最近的进展了解遗传因果关系和候选位点与疾病相关的希望。例如，大规模的全基因组关联研究也涉及到与IS相关的几个候选位点，包括与GPR126 (ADGRG6)、LBX1、CHL1和SOX9基因的关联(Guo et al.， 2016;Kou等，2013;Sharma等，2011;高桥等，2011)。脊柱侧凸是一种常见的表型的突变体小鼠模型,扰乱基因参与的开发和内稳态软骨和结缔组织,包括Adgrg6 / Gpr126(圆锥形石垒et al ., 2015), Sox9(亨利et al ., 2012), Shp2 (Ptpn11) (Kim et al ., 2013), Gdf5/6(解决et al ., 2003)和Fgf3(高et al ., 2015)。人类遗传数据和小鼠脊柱侧弯突变模型的收敛表明，脊柱软骨组织生理学和is发病机制之间存在潜在的关系(Liu和Gray, 2018)。

哺乳动物中骨性椎体的形成是通过胚胎发育期间脊索两侧的软骨化解角蛋白的软骨内成骨过程进行的。在出生后的发育过程中，椎体通过椎体生长板软骨细胞的增殖和分化继续生长和成熟(Smith et al.， 2011)。生长板融合通常发生在人类的青春期，但在成年小鼠中持续(Börjesson et al.， 2012)。椎间盘(IVD)连接脊柱的椎体，主要由软骨组织组成。髓核是IVD最内层的凝胶状中心，被许多纤维软骨板层包围，统称为纤维环。IVD的软骨终板组织在物理上连接到椎体生长板和骨性椎体。软骨内成骨是软骨细胞被骨取代的过程。虽然这一过程已在长骨中进行了大量研究，但其机制在椎体生长板中也有可比(Karsenty等人，2009;Long和Ornitz, 2013)。这一过程的特征是控制增殖、前肥大、肥大和终末期肥大软骨细胞分化的信号通路的连续性(Long和Ornitz, 2013)。椎骨的软骨内骨化始于椎体软骨化愈合骨的中心。骨化中心内的细胞退出细胞周期并开始肥大，其标志是分泌X型胶原蛋白(COLX;由Col10a1编码)。随后，基质金属蛋白酶13 (Mmp13)在这些细胞中表达，这对肥大软骨细胞的最终分化和软骨内骨形成至关重要(Inada etal .， 2004)。从机制上讲，MMP13有助于肥大软骨细胞周围富含colx的细胞外基质的降解，通过血管内皮生长因子(VEGFs)的表达促进血管的侵袭，并最终促进成骨成骨细胞的浸润(Karsenty等，2009;Long和Ornitz, 2013)。许多肥大软骨细胞发生凋亡，为骨基质的形成扫清了道路;然而，最近的研究表明，这些肥大软骨细胞的一部分转分化为成骨细胞，直接促进骨形成(Jing et al.， 2015;Park等，2015;Zhou等，2014)。

软骨细胞的成熟和终末分化受到一系列生长因子和转录调控因子的严格调控。例如，转录调控因子sry相关的高移动性组框9 (SOX9)对于软骨细胞增殖和防止早熟性肥厚分化是必需的(Akiyama et al.， 2002;Karsenty等人，2009)，而转录因子runt相关的转录因子2 (RUNX2)直接调控Col10a1、Mmp13和Vegfa的表达(Hess等人，2001;Li等，2011;高桥等，2017;Zelzer et al.， 2001)，是肥大软骨细胞分化和软骨内成骨的重要驱动因素(Komori, 2010a,b, 2018)。最后，印度hedgehog基因(IHH)信号通过PTHrP (Pthlh)依赖和独立的过程在软骨细胞增殖和肥厚分化中发挥关键作用(Amano et al.， 2014;Long和Ornitz, 2013年;Mak et al.， 2008)。在出生后的发育过程中，软骨细胞通过在脊柱软骨组织中细胞外基质成分的合成和降解之间保持动态平衡，继续调节脊柱的稳态。这些过程部分受到关键转录调控因子的调控，包括SOX9 (Henry等人，2012)和RUNX2 (Alvarez-Garcia等人，2018;廖等，2019)。

蛋白质精氨酸甲基转移酶5 (PRMT5)是一个关键因素参与建立软骨细胞的祖细胞在胚胎肢芽(Norrie et al ., 2016),导致早熟的Sox9表达其次是广泛的细胞凋亡和损失的软骨模板和四肢的骨骼元素(Norrie et al ., 2016)。在机制上，PRMT5是多种分子靶点对称去甲基化的关键酶，包括组蛋白H3R8、H3R2和H4R3 (Bedford和Clarke, 2009;Pal等，2004;Stopa等，2015;赵等人，2009)和小核核糖核蛋白(Chari等人，2008;梅斯特和费舍尔，2002;Stopa et al.， 2015)，分别影响mrna的基因表达和剪接。PRMT5也被证明可以调节SOX9蛋白的二甲基化，增加其半衰期(Sun等人，2019)。鉴于PRMT5的潜在分子底物范围，这种酶在许多组织特异性分化途径中发挥作用也就不足为奇了，包括角质形成细胞、肌肉、神经细胞和肺分化(Calabretta等人，2018;Chittka等人，2012;Dacwag等人，2009;Kanade和Eckert, 2012;Li等人，2018)。在本研究中，我们使用小鼠条件遗传学结合组织学和基因表达分析来确定PRMT5在椎体生长板中终端肥大软骨细胞分化和脊柱软骨内成骨过程中的新作用。小鼠骨软骨祖细胞中Prmt5的条件缺失显示出脊柱侧弯和围产期的致死率，使人联想到婴儿IS的自然病程。利用小鼠的诱导条件遗传学，我们还证明了成年小鼠的椎体生长板和软骨终板中PRMT5功能的持续作用。总之，我们的研究确立了PRMT5作为软骨组织发育、软骨内成骨和脊柱稳态的关键因素。

骨软骨祖细胞Prmt5缺失诱导小鼠早发性脊柱侧凸。(A) Col2Cre;Prmt5f/f突变小鼠在E18.5时以孟德尔比率产生(22.2%，n=18)，但在断奶前显示进行性死亡率(11.9%，n=42;P10时n=62，占5.4%;0%， P16时n=23)。(B,C)骨骼制剂在Col2Cre中显示出类似的大小和正常的脊柱模式;Prmt5f/f突变小鼠在E18.5与同窝Cre对照组相比(每组n=4)。(D-F”)x射线成像P10分析和量化显示突变小鼠早发型胸椎侧弯(F,F '，红色箭头)和增加的Cobb角(D)(每组n=4;每个点代表一只老鼠分析，用mean±s.d绘制;* *术;0.01,双尾学生的t检验)。矢状位x线图像显示突变体(F″)的远端肋骨骨化减少。控件(E″，黄色箭头)。(G-J)在突变小鼠胸椎(T5-T7)的MicroCT扫描显示更小的椎骨和在弯曲处(T6)轻度楔入的椎体(H) P10与对照组(G)比较。胸椎体microCT三维重建矢状面显示，与对照组相比，突变小鼠(J)的椎体内骨形成减少(I)。P10。(K-L”)免疫组织化学(包含IHC)对照(K)和突变(L)小鼠P10胸椎段PRMT5的分析。这些盒子勾勒出这些区域的轮廓在K′和L′中以更高倍率显示。比例尺:2mm (B、C);10毫米(E, F);50毫米(E, E, F, F”);1毫米(G-J);100µm (K-L”)。房颤,纤维环;EP,终板;GP,生长板;NP,髓核。

结果

小鼠脊髓模型中Prmt5的条件丢失

为了测试PRMT5在脊柱中的作用，我们将携带Prmt5f/f条件等位基因的小鼠(Norrie et al.， 2016)与Col2Cre小鼠(Long et al.， 2001)进行了交叉实验。Col2Cre等位基因在骨软骨祖细胞中显示了强大的Cre活性，并有效地标记了脊柱的大多数软骨谱系(Zheng et al.， 2019)。出生后(P)1，在IVD组织中，包括髓核、终板、纤维环，以及椎体生长板、骨膜和一些新形成的骨小梁组织中，可以观察到Rosa26-LacZ重组(图S1)。Col2Cre;在胚胎期(E)18.5 (22.2%， n=18)以孟德尔比率评估Prmt5f/f突变幼崽。然而，突变体动物在断奶前死于未知原因(P1时11.9%的存活率，n=42;P10时评估存活率为5.4%，n=62)(图1A)。在P16 (0%， n=23)，我们没有恢复任何Col2Cre;Prmt5f/f突变体。存活到P10 (n=4)的突变小鼠中，有两只比对照小鼠小得多(图1F)，而其他两只与同窝小鼠相似，表明外显率可变。在E18.5，全贴装骨骼制备显示Col2Cre的骨骼在大小、模式和成熟方面没有明显缺陷;每组N =4)。然而，在P10，我们观察到is样胸椎侧凸(图1F，红色箭头)，Col2Cre的平均Cobb角为30±4°;Prmt5f/f突变体(图1D;n = 4/4)。侧位x光片显示肋骨远端信号减弱。

相对于年龄匹配的同窝小鼠(图1E″，黄色箭头)，突变小鼠的骨矿化程度降低(图1F″)。为了进一步了解脊柱弯曲的本质，我们对两种Col2Cre的脊柱胸段(T2-T12)进行了微计算机断层扫描(microCT)分析;P10位点Prmt5f/f突变体和同窝对照组小鼠。呈现的microCT数据集清楚地展示了突变小鼠中观察到的胸曲度(图1G,H;图S2，片1和片2)。我们还观察到整体较小的椎体和椎体在曲度顶点有轻微的楔入(图1H, T6;图S2B，红色箭头)。在T6椎体水平的microCT数据矢状面切片显示Col2Cre;Prmt5f/f突变小鼠与对照组相比，骨小梁形成严重减少(图1I,J)。针对PRMT5的免疫组化(IHC)显示，野生型小鼠P10(图1K-L’)和P1(图S3)的椎体生长板、IVD终板和纤维环组织中PRMT5蛋白表达显著，在这些阶段，Col2Cre;Prmt5f/f突变小鼠的PRMT5蛋白表达一致降低。我们没有在骨小梁或皮质骨中观察到PRMT5的表达(图S3C,C’)，这表明PRMT5在定向成骨细胞系中作用有限。骨软骨前体细胞中Prmt5的缺失导致脊柱软骨内成骨的不对称缺陷，与我们的microCT观察结果一致(图1I,J)，我们观察到Col2Cre;Prmt5f/f突变小鼠在P1(图2B)和P10(图2D)的组织学上胸椎椎体软骨内骨化受损。在P1，这些突变小鼠表现出椎体软骨内成骨中心形成的延迟，同时IVD终板和椎体生长板中线裂隙增加(图2B '，B″，E中量化)。在条件型Adgrg6/Gpr126脊柱侧凸突变小鼠中观察到中线裂增加(Karner等人，2015)。这些脱细胞中线裂可能表明，在胚胎脊索从发育中的椎体区域收回到髓核时，软骨解角蛋白中线融合延迟(Smith等，2011)。在P10，我们观察到突变小鼠胸椎体软骨内成骨受损和骨小梁形成减少(图2D,D″)。在某些情况下，突变小鼠表现出明显的软骨内骨化不对称，甚至在邻近的椎骨(图2D，黄色星号)。我们还观察到软骨细胞的普遍组织紊乱，包括在椎骨中这些持续软骨区域内形成柱状或簇状(图2D″，红色和黄色虚线轮廓)。

我们还在P10位点的突变小鼠的一些IVD组织和椎体生长板中观察到一致的形态学改变。在对照组小鼠中，IVD终板包含几层用阿利新蓝轻度染色的扁平细胞(图2C’，绿色支架)。增殖/ prehypertrophic区控制生长板是由几层平的软骨细胞,组织成列(图。2 c,橙色支架),而肥厚性区域的生长板由两到四层扩大肥厚性软骨细胞(图2 c’,红色括号)。相反，终板中的Prmt5突变软骨细胞显得更大，周围基质的阿利新蓝染色更强烈(图2D’，绿色支架)。对这些细胞的定量分析显示，在Col2Cre;Prmt5f/f突变小鼠的椎体生长板的肥大区细胞层数增加，但在IVD终板中细胞层数没有增加(图2F)。我们还量化了生长板增殖/增厚前区细胞层数的少量增加(图2F)。我们一致观察到Col2Cre;Prmt5f/f突变小鼠的纤维环内外层的阿利新蓝染色比同窝对照组更强烈(图S4A,B)。为了确定这些形态改变是否具有区域特异性，我们在腰椎重复了相同的分析，观察到脊柱两个区域的相同表型(图S5B,B ')。总之，这些数据表明，PRMT5在椎体发育的几个方面，包括沿着整个脊柱轴的软骨细胞分化和软骨内成骨，都是至关重要的。

脊柱骨软骨祖细胞谱系中Prmt5的缺失导致椎体骨化的缺陷。(A-D) Cre对照(A,C)或Col2Cre;Prmt5f/f突变体(B,D) P1 (A,B)和P10小鼠胸椎Alcian Blue Hematoxylin/Orange G (ABH/OG)染色(C, D)。方框勾勒出A '、A″、B '、B″、C '、C″、D '和D″以更高倍率显示的区域。(A″，B″)P1相邻切片用藏红花素O/Fast Green (SO/ FG)染色。(B) Col2Cre骨化受损;Prmt5f/f突变椎骨(黄色星号)。(B '，B″)在突变终板中一致观察到中线裂的代表性图像，但在Cre对照小鼠中不太常见(A '，A″)(黄色箭头;对照组N =6，突变体N =5)。(D)Prmt5f/f突变小鼠(D，黄色星号)，在Cre对照小鼠(C)中骨化。软骨细胞在持续软骨区域的组织在列中发现(D″，红色箭头/(D″，黄色箭头/虚线(每组3个)。终板、增生性/增生性生长板和增生性生长板分别用绿色、橙色和红色标记。胸椎检查区域(T8, T9)标记在椎骨上。(E) ivd百分位数的量化包含控制组和控制组的中线裂IVD突变位点P1，见B-B″。每个点代表1小鼠分析，用平均值±标准差作图。(对照组为6只小鼠，突变体为5只小鼠)。每只小鼠检查4 ~ 6个胸椎ivd。(F)终板和生长板细胞层数的定量对照组和突变小鼠在P10，如C′和D′。每一个盒和须图中的点代表单个IVD和相邻生长板的计数分析。每个IVD和生长板分析三次并取平均值，每只小鼠至少分析两个IVD和生长板(每组n=3只小鼠)。*P<0.05，双尾学生t检验。比例尺:100µm。

骨软骨前体细胞中Prmt5的缺失导致COLX的表达和椎间盘中PRG4的表达减少。(A-D’)在Cre -对照(A,C)或Col2Cre;Prmt5f/f突变体(B,D)小鼠P10胸椎切片中对X型胶原(COLX) (A,B)和蛋白多糖4 (PRG4) (C,D)进行免疫组化分析。方框勾勒出A ' d '中以更高倍率显示的区域。突变小鼠表现出终板(B’，红色箭头)和生长板中COLX信号增加，终板和生长板中PRG4信号减少(D’)，这是一致的在Cre对照小鼠(C’，红色箭头)(每组3只)。比例尺:100µm。房颤,纤维环;EP,终板;GP,生长板;hGP，肥厚生长板;NP,髓核;pGP，增殖生长板。在脊柱软骨内成骨过程中，PRMT5调节软骨细胞分化的关键因子的表达

出生后脊柱软骨组织中Prmt5的消融导致正常基因表达的改变。(A)用于这些实验的floxed Prmt5等位基因出生后重组方案示意图。(B,C) Cre对照或ATC胸椎切片的β -半乳糖苷酶染色;5周龄Rosa-LacZf/+ (C)小鼠表明，在dox诱导后1周，IVD和生长板内实现了有效的重组。这些方框勾勒出在B '和C '中以更高倍率显示的区域。(D) Real-time RT-PCR分析了2.5月龄时采集的IVD和生长板组织，结果显示Prmt5、Mmp13和Prg4有效降低。酒吧代表的意思是南达科他州±。(每组n=3)*P<0.05， **P<0.01，双尾学生t检验。(E,F) Cre对照(E)或ATC胸椎切片的藏红花素O/Fast Green染色;Dox治疗后4个月大的Prmt5f/ F突变(F)小鼠。在突变小鼠中，除终板和生长板出现小裂外，未观察到明显的组织病理学变化(F，黄色箭头)。(G,H) Cre对照(G)或ATC胸椎切片;Prmt5f/f突变体(H)小鼠4月龄时COLX蛋白的免疫组化分析。这些方框勾勒出G '和H '放大倍率下显示的区域。突变小鼠的终板(H′，黑色箭头)和生长板(H′，红色箭头)中COLX信号增加和异位(每组n=3)。比例尺:100µm。房颤,纤维环;EP,终板;GP,生长板;NP,髓核。

讨论

椎体骨组织的形成，如长骨，是通过软骨内成骨过程发生的，在某些情况下，肥大软骨细胞被成骨成骨细胞系取代，并促进成骨成骨细胞系的形成(Aghajanian和Mohan, 2018)。我们的研究结果表明，PRMT5在终端肥大软骨细胞分化过程中发挥关键作用，随后在软骨内骨形成中发挥关键作用。我们展示了PRMT5对Mmp13和RUNX2表达的正向调控以及对Ihh表达的负向调控。我们还发现，骨软骨祖细胞中PRMT5的缺失导致了椎体生长板中肥大软骨细胞的扩张;然而，在围产期发育过程中，椎骨骨化严重受损，类似于Mmp13功能丧失的表型(Inada et al.， 2004)。最后，我们证明PRMT5对围产期软骨内骨形成的调控是婴儿期is的潜在机制。综上所述，这些结果确立了PRMT5作为终端肥大软骨细胞分化和软骨内骨形成的基本调控因子，以及围产期脊柱完整性的关键调控因子。