Ben Wang1,2,3      |   Zhenxuan Shao1,2      |   Mingbao Gu1,2      |   Libin Ni1,2      |

Yifeng Shi1,2      |   Yingzhao Yan4      |   Aimin Wu1,2      |   Haiming Jin1,2      |

Jiaoxiang Chen1,2      |   Xiaoyun Pan1,2      |   Daoliang Xu1,2

摘要

炎症环境和过度的软骨细胞凋亡已被证明在骨关节炎(OA)的发病中起关键作用。硫化氢(H2S)是一种气体信号分子，在多种退行性疾病中对细胞凋亡和燃烧有抑制作用。然而，H2S对OA的保护作用尚未完全阐明，其潜在机制有待进一步研究。在目前的研究中，内源性H2S在OA发病机制中的作用及其对白细胞介素(IL) - 1β -诱导软骨细胞的保护作用被确定。我们的数据显示H2S在人类退行性OA软骨组织和IL - 1β诱导的软骨细胞中的表达均下降。H2S供体氢硫化钠(NaHS)预处理显著减少IL - 1β -诱导的炎症细胞因子的过度产生，改善软骨细胞合成代谢和分解代谢能力之间的平衡，这些作用依赖于PI3K/ AKT通路介导的对核因子κB (NF - κB)的抑制。此外，在IL - 1β -刺激的软骨细胞中，NaHS显著逆转了线粒体功能障碍相关的凋亡。在机制上，NaHS部分抑制IL - 1β -诱导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联磷酸化。此外，在不稳定的内侧半月板小鼠模型中，NaHS可改善OA进展。综上所示，H2S可能通过选择性抑制软骨细胞PI3K/Akt/NF - κB和MAPK信号通路，拮抗IL - 1β诱导的炎症反应和线粒体功能障碍相关的凋亡，可能是一种潜在的OA治疗药物。

1.介绍

骨关节炎(OA)是最常见的关节炎形式，以关节软骨渐进性丧失、软骨下骨重塑和滑膜炎为特征(Barnett, 2018)。OA是一种不可逆的退行性关节疾病，其症状包括炎症、关节疼痛、肿胀和肢体受限等，有报道称OA是导致患者严重功能损害和进行性残疾的最重要原因(Heidari, 2011;李等，2013)。虽然OA的发病机制尚未完全了解，但普遍认为软骨细胞是关节软骨特有的驻留细胞，易受衰老、遗传易感性、创伤和代谢因素等多种危险因素的影响，这些因素导致关节间隙炎症反应的激活，最终导致OA的发生和发展(Haseeb & Haqqi, 2013;Li et al.， 2017;Scanzello, 2017)。

炎症介质，如白介素‐1β (IL‐1β)， IL‐6，和肿瘤坏死因子- α (TNF - α)，是由激活的滑膜细胞和关节软骨本身过量产生的炎症和OA病理生理之间有很强的相关性(Abramson et al.， 2001)。在这些细胞因子中，IL - 1β通过扰乱软骨稳态和促进catabo作用产生损伤作用(Kapoor等人，2011)。令人信服的证据表明，IL - 1β诱导的这些破坏性作用与随后的炎症级联反应和异常的心肌功能障碍密切相关(Csaki等，2009;齐等，2019)。一方面，据报道，IL - 1β升高会增加关节软骨中促炎因子的分泌，如环加氧酶- 2 (COX - 2)、IL - 8、TNF - α和IL - 6 (Hu et al.， 2018)，并触发细胞外基质(ECM)的合成代谢和分解代谢之间的失衡，主要由II型胶原和aggrecan组成(Goldring & Otero, 2011;Kelwick等人，2015年;Santangelo等人，2012)。ECM的恶化阻止OA软骨细胞维持软骨稳态和替换ECM成分(Abramson et al.， 2001;Kobayashi等人，2005)。然而，IL - 1β -诱导的软骨细胞炎症反应的潜在机制与核因子κB (NF - κB)信号通路的激活密切相关(Kumar等人，2004;Tak & Firestein, 2001)。现在普遍认为PI3K/AKT通路是NF - κB经典的上游信号通路之一，在软骨细胞炎症中发挥重要作用(Chen et al.， 2013)。此外，IL - 1β -介导的软骨细胞破坏作用可通过抑制NF - κB激活而显著逆转(Tang et al.， 2017)。另一方面，IL - 1β在体内和体外也可作为软骨细胞凋亡的介质(Charlier等，2016;Shakibaei等人，2007)。越来越多的证据表明软骨细胞凋亡与OA的严重程度密切相关(Mistry et al.， 2004;谢里夫等人，2004年;Thomas等人，2007)，并在人类关节软骨破坏和基质降解的进展中发挥关键作用(Musumeci等人，2011)。此外，线粒体途径是软骨细胞凋亡的相关机制之一，暴露于慢性炎症环境会引发异常的线粒体功能障碍，从而导致软骨细胞过度凋亡(Hwang & Kim, 2015)。此外，有报道称，有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，一种经典的上游凋亡通路，在OA发病机制中发挥了关键作用(Loeser等人，2008)。磷酸化p38和JNK的激活通过激活caspase级联反应诱导凋亡，而p‐p38和p‐JNK的抑制参与改善OA的严重程度(Sharifi et al.， 2010;Sui等人，2014)。因此，靶向和抑制NF - κB和MAPK通路可能是一种有希望的OA干预策略。

2   |   材料和方法

2.2    |   试剂和抗体

硫化钠(NaHS)、SP600125 (JNK抑制剂)、SB203580 (p38 MAPK抑制剂)、II型胶原酶、硫化物抗体:醌氧化还原酶(SQOR)、线粒体跨膜电位‐3 (MMP‐3)和iNOS均购自Sigma - Aldrich。重组人IL - 1β从PeproTech中获得。抗CBS和CTH的一抗是从圣克鲁斯生物技术公司获得的。从Abcam中获得抗II型胶原蛋白、aggrecan、MMP‐9、MMP‐13、ADAMTS 5、p‐ERK1/2、ERK1/2、Tom20、Drp 1和甘油醛3‐磷酸脱氢酶(GAPDH)的抗体，以及抗cleaved‐caspase 3、Bax、Bcl‐2 COX - 2、p‐p65、p65、p‐IκBα、IκBα、PI3K(p110)、PI3K(p85)、p‐AKT、AKT、p‐JNK、JNK、p‐p38、羊抗兔抗小鼠免疫球蛋白G (IgG) -辣根过氧化物酶(HRP)购自Bioworld。Alexa Fluor®488标记和Alexa Fluor®594 la- beled山羊抗兔IgG (H + L)二抗体从Jackson ImmunoResearch获得。4′，6‐Diamidino‐2‐phenylindole (DAPI)产自Beyotime。细胞培养试剂来自Gibco公司。   

2.3    |   人软骨标本采集及软骨细胞培养

整个研究经温州医科大学第二附属医院医学伦理委员会批准(伦理标准:LCKY‐2017‐36)，遵循《赫尔辛基宣言》(《世界和医学会赫尔辛基宣言:涉及人体的医学研究的伦理原则》，2013)。所有参与本研究的患者均提供知情同意。12例患者(年龄56-78岁，Kellgren’s GradeⅡ，n = 6;IV级，n = 6)，行全膝关节置换术。没有明显骨性关节炎影像学特征的正常人类关节软骨来自于除了接受上述膝关节截肢外别无选择的患者(年龄28-52岁，Kellgren’s 0级;n = 10)。软骨在Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F12中加入0.2%胶原酶II, 37°C处理4小时后切成1‐mm3块。随后，离心细胞块以2 × 105细胞/ml的接种密度接种于6孔板中，接种浓度为12%的胎牛血清和1%的抗生素，并在37℃、5% CO2的环境中培养。不迟于第二次传代的软骨细胞用于后续实验，以避免表型损失。

2.4    |   动物模型

共60只10周龄C57BL/6雄性野生型小鼠，来自中国科学院上海动物研究中心。小鼠OA模型是通过手术建立的内侧半月板(DMM)的失稳(Glasson et al.， 2007)。

简单地说，小鼠称重并腹腔注射2% (wt/vol)戊巴比妥(40 mg/kg);然后，用显微外科技术切开髌腱内侧的右膝关节囊，横切内侧半月板韧带。而对侧膝关节仅行关节切开术而未行关节置换，这最终被用作假手术组。术后将小鼠随机分为假手术组、DMM组和NaHS治疗组。

2.5   |   实验协议

在体外，为了评估H2S的抗炎和抗凋亡作用，我们分别用不同浓度的NaHS单独或联合IL - 1β (10 ng/ml)处理软骨细胞。在指定时间收集细胞培养上清液，进行无硫培养基回收。在IL - 1β刺激24或48小时后，收集参与凋亡研究的细胞。为了检测NF - κB和MAPK的激活，IL - 1β刺激持续时间为2小时。在孵育24小时后，研究炎症或ECM标记物等功能变化。

体内，术后NaHS治疗组小鼠行手术DMM，立即腹腔注射NaHS，剂量为100 mol/kg/d，连续8周。同时，DMM组只注射等量的生理盐水。每天对老鼠进行监测，以确保它们的健康。术后第8周腹腔注射10%水合氯醛处死动物，收集膝关节标本进行影像学和组织学分析。

2.6   |   实时聚合酶链反应 (PCR)

以4 × 105个细胞/孔的密度将软骨细胞植入6孔板中。将血清饥饿的细胞用il - 1 β (10 ng/ml)处理24或48小时。用Trizol试剂(Invitrogen)提取处理后的软骨细胞的总RNA。一微克总RNA被逆转录成互补DNA (cDNA;MBI Fermantas)。然后，共10 μl的反应量用于PCR扩增，其中2 × SYBR Master Mix 5 μl，每个引物0.25 μl，稀释cDNA 4.5 μl。反应和检测在CFX96 Real - Time PCR系统(Bio - Rad La- boratories)中进行。收集所有信使RNA定量数据并归一化至管家基因GAPDH的水平。数据处理采用2−ΔΔCt方法。CBS和CTH的引物如下:CBS:(正向)5‐GACCAA GTTCCTGAGCGACA‐3，(反向)5‐CGGAGGATCTCGATGGTGTG‐3;CTH:(正向)5‐GGCTCTACCTGCGTGCTTTA‐3，(反向)5‐C GAAATGTTGGAAGTGTGG‐3。

2.7   |    西方点墨法

使用含有1 mM苯甲烷磺酰氟的RIPA裂解缓冲液从软骨细胞中提取细胞蛋白。将裂解液置于冰上10 min, 4℃，12,000 rpm离心30 min;然后使用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime)定量检测各蛋白样品的浓度。等量的蛋白质经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯膜(BioRad)上。用5%脱脂牛奶封膜2小时后，与一抗在4℃孵育过夜，然后在室温下与二抗孵育2小时。用TBST洗涤三次后，用Che- miluminescence Reagent Plus (Invitrogen)观察印迹，最终用Image Lab 3.0软件(Bio‐Rad)定量。

2.8    |   细胞因子/趋化因子的量化

用Cell Counting Kit‐8 (CCK‐8;这是根据制造商的协议规定的。软骨细胞在96孔板(50,000细胞/cm)中培养24小时，然后单独用不同浓度的NaHS (0-4 mM)或与IL - 1β联合培养24小时。然后，软骨细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，每孔加入含10 μl CCK‐8溶液的DMEM/F12 100 μl，然后在37°C孵育2 h。最后，使用分光光度计(Thermo Fisher Scientific)在450nm处测量每个孔的吸光度。

2.10    |   钙黄绿素AM/碘化丙啶(PI)细胞活力测定

使用黄绿素AM/PI (Sigma - Aldrich)双染色法进一步测定细胞活力。贯穿细胞的非荧光黄绿素AM在活细胞中产生均匀的绿色荧光，而PI在无活细胞中产生亮红色荧光。NaHS单独或与IL - 1β联合作用24小时，随后用PBS洗涤两次。然后，在每个培养液中加入2 μM calcein AM和15 μg/ml PI (100 μl PBS)， 37℃孵育30 min。使用荧光显微镜(Olympus Inc.)评估荧光。

  2.11   |   免疫荧光

  上述相关治疗后,软骨细胞与胶原蛋白II的4%多聚甲醛固定,p65,组成1和Tom20染色,然后其次是渗透使用0.1% Triton X 100在PBS稀释了15分钟,然后用5%牛血清白蛋白细胞被封锁在37°C, 1 h细胞与II型胶原(1:200)孵育;或将抗滴滴剂1(1:250)和抗Tom20(1:200)混合，在4°C的湿室中过夜。次日，洗涤细胞，用Alexa Fluor®488标记的或Alexa Fluor®594标记的第二抗体(1:400)在室温下孵育1 h，用DAPI标记5 min。最后，随机选择每张载玻片的三个区域，用荧光显微镜进行显微镜下观察。采用ImageJ 2.1软件(Bethesda, MDUSA)，观察者对实验组不加观察，测量荧光强度。

2.12   |   ATP 检测

ATP‐GloTM生物荧光细胞活力测定(Biotium)用于根据制造商的协议评估细胞ATP水平。每个实验都从多个重复井中收集数据。

2.13   |   透射电子显微镜法

将人软骨细胞在4°C 2.5%戊二醛中固定过夜，然后在2%四氧化锇中固定1小时，用2%醋酸铀酰染色1小时。样品在丙酮中脱水后，嵌入araldite中，切成半薄片，然后用甲苯胺蓝染色定位细胞，在透射电子显微镜(日立)下观察。

2.14   |   线粒体通透性过渡孔(mPTP)开放

mPTP的开放度根据制造商的协议使用钙黄绿素AM/CoCl2荧光猝灭试验(分子探针;英杰公司)。

2.15   |   TUNEL染色

软骨细胞固定paraf刚做好的4%——ormaldehyde 1 h,然后终端deoxynucleotidyltransferase (TdT) dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色法是由使用一个原位细胞死亡检测设备(罗氏)根据制造商的指示在一个黑暗的,湿润的房间。DAPI染色细胞核。荧光显微镜下凋亡细胞DNA链断裂阳性染色。

2.16    |   MMP 测定

MMP使用MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Thermo Fisher Scientific)评估。处理后，软骨细胞用50 nM MitoTracker Red在37℃下染色30分钟，核用Hoechst 33258染色10 min。荧光显微镜下，每张载玻片至少随机取10个显微镜视野的红色荧光图像进行观察，使用ImageJ软件2.1测量荧光强度。

2.17    |   X‐ray 成像

所有动物均于术后第八周行X线检查。X射线成像使用数字X射线机(Kubtec Model XPERT.8;KUB Technologies Inc。)

2.18    |   免疫组织化学检查

石蜡包埋切片脱蜡再水合后，用3%的双氧水阻断内生过氧化物酶活性。随后用0.4%的胃蛋白酶(Sangon Biotech)在5 mM盐酸中37°C孵育20分钟用于抗原提取。然后，5%的牛血清白蛋白在室温下阻断非特异性结合位点30分钟。切片与一抗在4°C孵育一夜，最后与适当的HRP偶联二抗(Santa Cruz Biotechnology)孵育。使用Image‐Pro Plus软件6.0 (Media Cybernetics)对图像进行分析。每组各5个切片进行定量分析。

2.19    |   统计分析

结果以均数±SD表示。使用SPSS统计软件(版本20.0;IBM)。数据采用单因素方差分析，然后采用Tukey检验进行对照组和治疗组之间的比较。采用Kruskal-Wallis H检验分析OARSI评分、SCB厚度和滑膜炎评分。p值小于。05被认为是显著的。

  为了确定内源性H2S是否参与OA的发病过程，采用western blot和real - time PCR检测H2S生成和H2S代谢酶的表达水平。CBS和CTH是参与内源性H2S生成的两种主要酶(Wang et al.， 2011)，而SQOR是一种膜结合酶，参与H2S的线粒体代谢(Jackson et al.， 2012)。Western blot分析显示，OA患者软骨组织中CBS和CTH蛋白水平明显下调(图1b、c)，与OA的降解程度一致(图1a)。有趣的是，在SQOR表达式中没有检测到显著的变化(数据没有显示)。类似地，IL - 1β -刺激软骨细胞变性的结果进一步证实了之前的发现，在蛋白质和基因水平上观察到生成酶的下调，并以时间依赖的方式(图1d-g)。

3.2   |   外源性H2S可抑制IL - 1β -诱导的软骨细胞中炎症细胞因子的产生和凋亡

为了研究外源H2S是否能抑制IL - 1β -诱导的细胞因子自发分泌，用ELISA试剂盒分析细胞培养上清。如图2a,b所示，虽然抑制作用不是持久的，但NaHS处理会导致IL - 6自发产生的浓度依赖性减少。NaHS治疗还导致其他炎症细胞因子下调，如IL - 8和TNF - α(图2c)。当细胞被IL - 1β刺激时，也得到了类似的结果(图2d,e)。此外，NaHS抑制IL - 1β -诱导的炎症介质iNOS和COX - 2的表达上调(图2f,g)。另一方面，通过CCK‐8检测和western blot检测NaHS对软骨细胞的潜在细胞毒性和抗凋亡作用。我们的数据表明，NaHS在浓度高达1 mmol/L时不影响软骨细胞的活力;相比之下，NaHS显著逆转IL - 1β诱导的细胞凋亡(图2h,i)。此外，western blot分析显示，NaHS抑制IL - 1β -诱导的凋亡蛋白(如cleaved caspase 3和Bax)的上调表达，而NaHS预处理后凋亡蛋白Bcl - 2表达上调(图2j,k)。通过TUNEL实验进一步证实了NaHS的抗凋亡作用，如预期的那样，给药后IL - 1β -刺激的升高的TUNEL阳性细胞显著逆转(图21,m)。

3.3   |   NaHS可以改善IL - 1β -刺激的软骨细胞的ECM合成和降解es

为了检测软骨细胞的变性，我们用western blot方法评估ECM的替换情况。如图3a-d所示，IL - 1β sig-显著降低了II型胶原和聚合蛋白的合成，上调了MMPs和ADAMTS - 5的表达。IL - 1β刺激引起的所有破坏性改变均可通过NaHS预处理显著逆转。

NaHS对IL - 1β -诱导的人软骨细胞ECM合成和降解的影响。(a-d)上述软骨细胞中Col II、aggrecan、MMP‐3、MMP‐9、MMP‐13和ADAMTS 5的蛋白表达及条形图。(e, f)免疫荧光联合DAPI核染色检测具有代表性的II型胶原，比例尺:50 μm。所有实验均重复3次，n =3。* p & lt;. 05, * * p & lt;.01与对照组相比，. 05, p # # & lt;.01相对于IL - 1β组。DAPI, 4′，6‐二氨基‐2‐苯基吲哚;ECM,细胞外基质;IL,白介素;MMP、线粒体跨膜电位通过检测IL - 1β诱导的炎症中被激活的上游PI3K/Akt通路分子阐明了NaHS的抗炎机制。Western blot分析表明，IL - 1β显著诱导PI3K‐p110催化亚基和PI3K‐p85调节亚基的上调，而NaHS处理显著逆转了这一反应。同样，NaHS也抑制IL - 1β -诱导的AKT磷酸化(图4e-g)。

NaHS对IL - 1β诱导的PI3K/AKT /NF - κB活化的影响(a, b)经IL - 1β处理后的软骨细胞中p65和磷酸化p65的蛋白表达和条形图。(c, d)单独或联合IL - 1β处理2小时的软骨细胞中p‐p65, p65, p‐IκBα和IκBα的蛋白表达和条形图。(e-g)上述处理的软骨细胞中PI3K(p110)， PI3K(p85)， p‐AKT和AKT的蛋白表达和条形图。(h)免疫荧光结合细胞核DAPI染色检测p65的细胞核易位，比例尺:20 μm。所有实验均重复3次，n =3。* p & lt;. 05, * * p & lt;.01与对照组相比，. 05, p # # & lt;.01相对于IL - 1β组。DAPI, 4′，6 -二氨基- 2 -苯基吲哚;IL，白介素;NF‐κB，核因子κB组(图5a)，表明NaHS对IL - 1β -诱导的细胞死亡有保护作用。

   NaHS对IL - 1β -诱导软骨细胞线粒体功能障碍的影响。(a)通过黄绿素AM/PI双染色监测细胞存活，并通过荧光显微镜定性分析，比例尺:50 μm。(b, c) drp1与Tom20在软骨细胞中共定位的免疫荧光双标记染色，比例尺:10 μm。(d) ATP含量通过ATP‐Glo生物荧光法测定细胞活力。(e)软骨细胞线粒体变化的TEM图像(×25,000)。三角形:线粒体分裂;星号:线粒体肿胀伴嵴骨折;箭头:线粒体碎片。(f)用钙黄绿素‐AM和CoCl2负载检测mPTP开口。比例尺:50 μm。所有实验均重复3次，n =3。* p & lt;. 05, * * p & lt;.01与对照组相比，# <05年,# #术;。与IL - 1β组相比。IL,白介素；PI、碘化丙啶磷酸化ERK1/2、JNK和p38的磷酸化被NaHS明显下调(图6d-f)。

4    |   讨论

随着全球人口老龄化和肥胖的增加，膝关节骨性关节炎的患病率正在飙升。据估计，60岁以上的男性中有10%患有骨性关节炎，女性中有18%患有骨性关节炎，骨性关节炎正在成为全球公共卫生和社会经济的主要负担(Barnett, 2018年)。尽管近年来软骨降解的分子生物学已被广泛研究(Gossan et al.， 2013;Stolz et al.， 2009)， OA的发病机制仍未完全阐明，目前也没有治愈性治疗逆转OA的进展(Mandl, 2019)。因此，迫切需要能够逆转软骨破坏的新型药物。

采用含硫热水的浴疗疗法是一种古老的治疗方法，至今仍被用作肌肉骨骼系统疾病(如OA)患者的治疗策略。正如之前报道的，许多OA和风湿性疾病患者在接受2-3周的水疗含硫泥浆浴治疗后，临床症状明显缓解(Costantino等人，2012年)。最近的一项研究表明，H2S可能是硫磺浴治疗效果的主要贡献者(Kloesch等人，2010)。此外，人类软骨细胞具有合成H2S的能力，低水平(微磨牙)的H2S已被发现对炎症前介质有保护软骨的作用(Fox et al.， 2012;Whiteman等人，2010)。有趣的是，降低了两个关键H2S合成酶的表达水平。

结论

我们的研究结果表明，H2S可能是软骨细胞稳态和骨关节炎发展的重要调节因子。此外，NaHS治疗可防止人软骨细胞IL - 1β相关的炎症和凋亡。NaHS的抗炎作用的潜在机制包括通过PI3K/AKT通路抑制NF - κB的激活，而抗凋亡作用通过MAPK通路抑制线粒体功能障碍(图9)。提示NaHS可能是一种有前途的OA治疗策略。